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ELISA实验室常见问题及缘故原由剖析
供稿：手艺部
宣布时间：2022-05-04
浏览量：2416次
高配景/非特异性染色
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效果形貌 ? |
可能的缘故原由 |
建议及预防步伐 |
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终止后,整板效果展现均一的黄色或浅色;或标曲有线性但配景过高 |
整版发黄征象可能由于错加其他试剂造成 |
实验前检查试剂的组分及批号,确认所有组分均属于对应的试剂盒.差别试剂盒或差别批号 |
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未充分洗濯酶标板 |
确保洗濯历程中每个微孔所加入洗涤液量一致.洗濯完成后,将酶标板用力按压在吸水纸上,以除去剩余的缓冲液. |
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孵育时间过长 |
请严酷凭听说明书办法操作 |
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酶标记物污染了吸头及盛放显色剂容器或阳性比照污染了微孔 |
吸收差别的试剂时应替换吸头,设置差别的试剂组分时,应使用差别的贮存器皿,操作时请使用移液器 |
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检测抗体货Avidin-HRP的浓度过高 |
检查浓度盘算是否准确或进一步稀释后再使用 |
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底物在使用前曝光或污染 |
加入底物前,应始终避光生涯 |
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显色时间过长 |
请严酷凭听说明书办法操作 |
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读取了吸光值时使用了过失的滤光片 |
TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值,并以650nm作为校正波长 |
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白板
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效果形貌 ? |
可能的缘故原由 |
建议及预防步伐 |
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显色办法竣事后,酶标板所有孔均无颜色;阳性比照不显着 |
组分试剂混淆使用 |
配制或使用时应看清晰标签 |
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洗版及加样历程中,酶标物受污染失活失去催化显色剂显色的能力 |
确认盛酶标的容器不含酶抑制剂(如NaN3等),确认配制洗液的容器已洗清洁. |
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遗漏了某种试剂或某个办法 |
详细审阅说明书,并严酷遵照操作办法 |
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显色淡
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效果形貌 ? |
可能的缘故原由 |
建议及预防步伐 |
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包括标曲、样本在内的所有板孔颜色均较淡 |
试剂盒凌驾有用期或贮存不当 |
请在有用期内使用,并凭听说明书推荐的生涯条件生涯,阻止污染 |
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试剂、样品用前未平衡 |
所有试剂、样品应置室温平衡30min左右 |
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移液器吸量缺乏,移液抽吸排放太快,吸头内壁挂液太多或内壁不清洁 |
校正移液器,吸头要配套,每次吸头要吻合细密,移液不宜过快,排放应完全.吸头内壁要清洁,最好一次性使用. |
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孵育反应时间缺乏 |
准时器准确准时 |
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显色反应缺乏 |
一样平常在15-30min |
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洗涤次数增添,浓缩洗液稀释倍数不切合要求 |
镌汰洗涤攻击力,凭听说明书要求稀释浓缩洗液、洗涤时间,准确纪录洗涤次数及用量 |
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蒸馏水水质有问题 |
设置好的洗液一定要检测PH值是否呈中性 |
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洗板及加样历程中,酶标物受污染失活而失去催化显色剂显色的能力 |
确认盛酶标的容器不含酶抑制剂(如NaN3等),确认配制洗液的容器已经洗清洁,确认设置洗液的纯化水抵达要求且未受污染. |
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标曲正常,样本显色较淡 |
样本使用NaN3防腐剂,抑制了酶的反应 |
样本不可使用NaN3 |
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待测样本中可能不含强阳性标本,故效果可能是正常的 |
若有嫌疑,可以复检 |
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目测效果正常,但酶标仪读值偏低 |
读取吸光值时使用了过失的滤光片 |
TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值,并以650nm作为校正波长 |
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标准曲线不佳/重复性欠好
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效果形貌 ? |
可能的缘故原由 |
建议及预防步伐 |
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重复性差 |
标准品配制有误 |
严酷凭听说明书标准品配制举行操作,仅使用推荐的稀释液对标准品举行稀释 |
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试剂盒贮存要领不当或贮存情形太差 |
请在说明书推荐的条件下生涯,不要将重悬后的组分在室温安排时间过长 |
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过早稀释各事情组分 |
各事情组分请在使用前10分钟设置,并连忙加入到微孔中 |
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样本加入后未混匀 |
针对同时加入多种试剂组分,加样后在混匀器上充分混匀,注重稳拿稳放,避免外溅 |
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酶标仪测定重复性差 |
校准酶标仪 |
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孵育时间、洗涤条件、显色条件、操作职员纷歧致 |
重复测定标本,反应条件、职员等尽可能与上次坚持一致 |
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洗涤不准确 |
移液器准确加入200?l/孔洗涤液或注满各孔,但不要溢出.洗板机洗板时不应有堵孔,洗涤应充分 |
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孵育温度恒温效果欠好 |
坚持温度恒定,阻止局部温度过高过低 |
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加液时,过多残留于孔壁上 |
加液时,吸头在不遇到孔底的条件下只管沿着孔壁下方加液 |
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耗材重复使用 |
吸收差别的试剂时应替换吸头,设置差别的试剂组分时,应使用差别的储液器皿 |
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微孔底部被划伤或者保存污垢 |
操作时仔细,注重不要触碰底部擦拭酶标板底部,以去除污垢或者指纹 |
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阈值周围时阴时阳 |
统一样品做3个复孔,以2个(含2个以上相同效果为准) |
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加样时交织污染 |
加标本时只管阻止交织污染 |
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泛起随机性的花板、跳孔征象 |
手工洗板造成的交织污染 |
手工洗板时前3次注洗液后应连忙弃去,后一再再设定浸泡时间,可以镌汰交织污染 |
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拍板时交织污染 |
拍板时用合适的吸水纸巾,不要把无关物质拍进板孔,并只管不要在统一位置拍,以免交织污染 |
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洗板机加液头梗塞导致加液不满或吸液残留量较大,造成花板、跳孔 |
疏通加液头,使洗板时每孔均注满洗液,吸液时残留量要小 |
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样本离心处置惩罚不全,致使反应孔内爆发凝血征象或保存沉淀物或残留细胞因素滋扰 |
血清血浆应充别离心,3000rpm 6min以上 |
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样品安排时间过长,污染 |
样品应坚持新鲜,或低温生涯,避免污染 |
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洗涤液配制有误或直接误用浓缩洗涤液 |
请按说明书设置 |
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