RNA样本准备指南-金狮贵宾会3420055

手艺专栏

RNA样本准备指南

供稿：手艺部

宣布时间：2022-06-06 金狮贵宾会-宾至如归-尊贵-显赫

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1、样本RNA得率以及种种项目最低起始量

各样本Total RNA得率统计（仅供参考）：

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测序项目推荐起始量（起始量仅供参考，外泌体不允许18s/28s rRNA有峰）：

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表达谱芯片及小RNA测序体液样本及外泌体项目起始量（仅供参考）

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2、种种样本准备指南

2.1 动物组织/临床组织收罗

① 取新鲜组织，组织体积要小，只管长宽高≤0.5cm，思量到可操作性，所切组织块的巨细可参考绿豆颗粒的巨细

② 去除非研究的组织类型（如结缔组织，脂肪组织等），若是是临床病变组织的取材要准确判断病变以及正常组织，应将病变组织周围的正常组织去掉，反之亦然。

③ 迅速用2-6℃预冷RNase-Free水配制的1×PBS或心理盐水洗濯组织外貌的血迹和污渍，使用无尘纸巾吸干外貌的液体

④ 处置惩罚好的组织迅速放入预冷好的已写好编号的RNase-Free的带螺纹口的耐-192℃超低温冻存管中，迅速置于?液氮速冻1小时后转存于-80℃恒久生涯，在RNA提取前阻止重复冻融。

注重事项：

a. 若是实验室没有条件，如缺乏液氮、干冰以及-80℃冰箱等条件下，需要RNAlater及类似组织生涯液生涯的样本，严酷凭证操作说明举行，迅速的将样天职割生长宽高≤0.5cm，约豌豆巨细的小块（一样平常重约100mg，不过无需精准丈量，一样平常需要10个小块左右），由于组织块过大会影响RNAlater渗透入组织内部的效率，组织块过大也会造成RNAlater无法完全笼罩组织，而未被RNAlater笼罩的组织部位极易被核酸酶降解。然后投入提前准备好的装满RNAlater的1.5mL的EP管中，使样本完全浸没在液体中，然后置于4℃中生涯住宿，干冰运输，或-80℃生涯。

b. 不允许寄送用裂解液生涯的组织样本，由于实验中发明用Trizol生涯的组织样本，无论是研磨好的粉末照旧切割好的组织块，所抽提的RNA质量普遍很差；

c. 动物及临床组织不要使用锡箔纸包裹，锡箔纸容易与动物及临床组织粘一起，RNA抽提的历程锡箔纸容易带入，引起污染。

2.2 细胞样品的收罗

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贴壁细胞的处置惩罚：

① 从作育箱取出贴壁生长细胞，显微镜下视察细胞确定生长状态优异弃作育基

② 小心加入与作育基等体积的无酶水配制的1×PBS后，平放1min洗涤细胞，然后弃去PBS，重复一次

③ 加入适量裂解液重复奏乐至充分裂解（以TriZol为例，10-15cm的大皿，每次先添加1-2mL，奏乐混匀，裂解充分的标准为奏乐时液体不粘稠，流动性好。若是液体过于粘稠说明还未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建议为100μL左右一连添加，直到液体不粘稠为止）

④转移至?耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，-80℃冰箱恒久生涯，干冰运输

悬浮细胞的处置惩罚：

①选取生长状态优异的细胞悬液

②200-1000g离心5-10min，获得细胞沉淀弃作育基

③加入适量 RNase-Free水配制的1×PBS后，宽口枪头轻柔奏乐重悬细胞沉淀，然后用200g离心5min，弃PBS，重复一次

④加入适量TriZol裂解液重复奏乐至充分裂解（裂解标准同上面的贴壁细胞处置惩罚方法类似）

④转移至?耐-192℃低温的螺纹口冻存管后，-80℃恒久生涯，干冰运输

注重事项：

a. 勿将干冻的细胞直接寄送，由于细胞冷冻的历程中冰晶很容易刺破细胞，此时破碎的细胞会容易对RNA和RNA降解

b. 细胞样品勿用胰酶消化，胰酶会消化细胞膜上的膜卵白，导致细胞破碎，破碎的细胞会释放核酸酶。

2.3 植物组织组织收罗

①选取新鲜、幼嫩、生长兴旺的组织部位，植物组织越幼嫩越新鲜所含的次生代谢产品越少，随着植物的逐渐成熟，所含的次生代谢产品产量越来越多，而次生代谢产品会影响RNA的抽提。以草莓的花为例，这么个体量的花，4朵即可，其它花朵样本一次类推。

②（部分样本可选项）迅速用预冷的RNase-Free水配制的1×PBS或心理盐水洗濯组织外貌的污渍，吸干外貌的液体。用铰剪剪切成合适的大�。ㄈ舴翘厥馇樾�，长度最好不要凌驾2cm）

③处置惩罚好的组织迅速放入预冷好的已写好编号的RNase-Free的?耐-192℃低温的螺纹冻存管中，或用标记好名称的锡箔纸包裹好，?液氮速冻>1小时，转移到-80℃恒久生涯,在RNA提取前阻止重复冻融，干冰寄送样本。若在离体后10min未用液氮速冻降温，极有可能引起样本降解。不可直接将样本放入-80℃生涯，此时低活性的RNase仍能引起样本降解

注重事项：

a. 植物组织不建议RNAlater生涯，由于植物组织含有细胞壁及次生壁，RNAlater不易渗透入组织内部；特殊是外貌有蜡质的植物莳植，勿用TriZol直接浸泡植物组织

b. 不允许将植物组织磨成粉寄送。

c. 外貌含有较多蜡质的植物样本或次生代谢产品含量极高的植物组织或植物组织的茎和根及种子RNA得率通�；峤系�，为提高RNA的得率需要加大送样量，为通俗样本送样量的3-4倍。

2.4 全血/PBMC/血清/血浆以及其他体液样本搜集

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联川生物推荐使用BD公司的PAXgene?采血管收罗全血，使用BD公司的真空采血管收罗全血后疏散血清，或使用EDTA紫色抗凝管搜集全血样本以及疏散后续的血浆样本。不允许使用绿色的肝素采血管收罗全血，由于肝素会影响PCR酶的逆转录效率。

a. PAXgene采血管收罗全血方法：

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①采血前，应将采血管恢复室温，推荐温度为18-25℃（一样平常PAXgene采血管生涯于室温或4℃，最高不凌驾40℃）

②采血时，若是前面已经使用了多种采血管收罗血液时，应该在最后使用PAXgene采血管；仅用PAXgene采血管时，先用另一个采血管收罗1-2mL血样，扬弃该采血管，再使用PAXgene采血管。这种作用是由于，采血器容积能被预灌注，另镌汰血压造成的攻击力，一定水平上洗濯采血管，采血量：2.5ml，适用工具：人和灵长类动物。

③采血后，连忙上下倒置混匀十次左右，18-25℃正立安排2h。④ 若不连忙提取，将采血管正立置于塑料试管架上（注重：试管架与采血管之间需留有逍遥，避免低温生涯历程中管壁开裂），先于-20℃安排24h,然后转移至-80℃举行恒久生涯或转移至干冰中举行运输。注重，在这一步中需要把采血管中的全血样本转到螺纹口冻存管即可放入-80℃冰箱，无需再将冻存管在?液氮速冻1小时。

⑤运输时请使用厚壁泡沫盒，放入富足的干冰，在样品生涯及运输历程中应阻止重复冻融。

b. EDTA采血管/真空采血管收罗全血方法：

①样本收罗前，先用75%的酒精棉由内向周围对采血部位举行消毒

②采血至特定的采血管中，数目抵达负压允许的最大值

③样本收罗完成后，连忙轻柔倒置混匀10次。行动尽可能平缓。加入三倍以上体积的TriZol（TriZol:血液≥3:1）裂解液混匀，此时泛起沉淀为正常情形。

④混匀完毕后，连忙转入?耐-192℃低温的螺纹口冻存管，转入-80℃冰箱生涯，干冰运输。注重采血至提取RNA最长时间不得凌驾一周。

c. 血浆中PBMC提取法：

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①接着上一步EDTA抗凝管离心后分层那一步，将Ficoll和PBS从低温恢复到室温

②向50mL离心管（标记A）中加入10mL Ficoll，随后最好静置一段时间；向另一只50mL离心管（标记B）加入10mL PBS

③稀释：温顺摇匀抗凝采血管，用 kimwipes或者消毒纱布移除上盖并放一边，将 10mL血液转移至B离心管，温顺混淆，获得PBS混淆液（20mL）

④适度倾斜离心管A，将20mL PBS 混淆液沿壁缓慢加入（注重要缓慢，过快会穿破Ficoll层，极大影响提取效果）

⑤梯度离心：小心地将离心管放入离心机（不要扰动液体层），室温400g 20min离心，加速/减速划分设置为1/0

⑥离心之后小心将其取出，安排于操作台上，可见分为四层，见上图

⑦可�。合纫瞥馨拖赴闵�2-3mm的血浆，利便后面吸收

⑧用P1000移液枪尽可能吸收PBMC，转移至15mL离心管，只管阻止吸收血浆和Ficoll

⑨加入PBS 使体积变为10mL，盖上盖并温顺翻转摇匀5次

⑩室温 300g 10min离心，加速/减速划分设置为9/9。去上清并轻弹离心管最后，直至细胞团在剩余PBS中完全重悬

注重事项：重复办法⑨-⑩，最后凭证TriZol和体积约3:1的比例加入TriZol包管充分裂解，裂解标准请参考上面贴壁细胞裂解液处置惩罚方法

d. 血清样本（外泌体适用）

①建议使用入口医用血清管或真空采血管等网络全血

②上下轻轻倒置混匀十次后，连忙将全血置于4°C或冰盒中正立安排

③1800g 10min离心疏散获得上层血清样本（全血需在1h内举行血清疏散，依据血清管操作说明或客户实验室血清疏散办法举行操作）

④将血清转移至1.5mL离心管中，13000g离心2min；

⑤将上清转移至规格在200μL-1.5mL耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，每份样本至少≥100μL（0.1mL）。?液氮速冻1h后-80℃生涯，干冰运输

e. 血浆样本（外泌体适用）

①建议使用紫色EDTA抗凝管网络全血样本

②上下轻轻倒置混匀十次后，连忙将全血置于4°C或冰盒中正立安排

③1200g 10min离心疏散获得上层血浆样本（全血需在1h内举行血浆疏散，依据抗凝管操作说明或客户实验室血浆疏散办法举行操作）

④将血浆转移至1.5mL离心管中，13000 g离心2min

⑤将上清转移至规格在200μL-1.5mL耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，每份样本至少≥100μL（0.1mL）。?液氮速冻1h后-80℃生涯，干冰运输

注重事项：

a.疏散血清血浆应严酷凭证操作说明举行，操作需在1h内完成，阻止泛起溶血征象，血清血浆疏散后阻止重复冻融。

b. 血清血浆送样量的原则：越多越好，若是客户手头上的血清血浆量较少，则有几多就送几多，通常该种类型的样本RNA含量较低，以是需要通过加大样本量以富集足够多的RNA，以包管后续实验的顺遂举行，别的血清血浆RNA通常不质检

c.疏散血清/血浆样本的全血不可冷冻，混入的血细胞的样本只管弃尽，已无法使用

d血清/血浆的RNA得率为2-8ng/mL

小贴士——

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溶血征象诠释：即因红细胞细胞膜的破碎而导致的红细胞破碎、血红卵白溢出的征象。溶血可由多种物理或化学因素引起，尤其在人体外，渗透压的转变、机械外力，温度的转变，酸碱度的转变或血液处置惩罚的历程中人为添加的一些化学物质，均有可能引起差别水平的溶血

溶血应对战略：(1)血液脱离人体后，血液情形的稳固性与生涯时间的是非呈反比，细胞膜的稳固性也在下降，在这种情形下，应尽快开展血清血浆的疏散；(2)差别的抗凝剂有其差别的分子构型，会对血液中各细胞的细胞膜爆发差别的作用，有的会增添细胞膜的稳固性，有的会降低细胞膜的稳固性，以是选择一款合适的抗凝剂至关主要（抗凝剂推荐：EDTA、柠檬酸钠）；(3)血液存放历程中温度过高或重复冻融对细胞膜有很大的损害。温度过高及重复冻融会使细胞膜上的结构卵白构象爆发改变，进而造成细胞膜的弹性降低以致破解爆发溶血征象，以是用于疏散血清血浆的血液应阻止重复冻融

f. 细胞上清液、尿液、唾液、羊水、脑脊液（外泌体相似）

①网络细胞上清液、新鲜尿液、唾液、羊水、脑脊液（起始量凭证前面表格中提醒），要确保不可溶血（血液中卵白会污染样品卵白）；置于4°C 或冰盒中正立安排，转移至RNase-free离心管。以下操作请在样本网络后的1h内举行，以防RNA降解

②在4°C条件下离心3000g约10 min，去除细胞及碎片

③将上清小心倾倒入新的RNase-free离心管（注重不要转移沉淀），在4°C条件下离心13000g约2 min，去除残留的碎片及细胞

④转移上清至全新的耐-192℃超低温螺纹口冻存管中，?液氮速冻1h（可�。�，严密封口。-80°C生涯，干冰运输

注重事项：细胞上清液碎片过多，需要充分低速离心多次去除碎片。网络尿液的前一天饮食要清淡，晨起中段尿（临床），晨间1h的尿液（动物）。唾液搜集之前需要禁食禁烟禁酒2h以上，上午9:30-11:30取样，蒸馏水漱口，将唾液吐于无菌的痰杯（坚持水�。�，不要咳痰，收罗唾液时间为30min左右，4℃ 10000rpm 10min，取上清，经0.22μm滤膜过滤除菌。

2.5 石蜡组织

手术/活检组织石蜡块

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RNA单次提取需35mg以上的量。从医院病理科切取手术组织总量≥35mg（绿豆巨细，不可取袒露于空气中的组织截面部分），活检组织长度>1cm，需2-3条，蜡块完整，无磕碰损伤的石蜡包埋组织。未切片的石蜡块4℃或常温运输即可

手术/活检组织石蜡卷片/活检组织石蜡切片

RNA提取一次提取<80μm。从医院病理科切取组织厚度约为10-20μm的石蜡卷片，手术组织10张（组织>1×1cm2），或20张（组织<1×1cm2），穿刺组织20-25张。将切好的卷片安排于耐-192℃超低温螺纹口冻存管，迅速浸入液氮速冻>1h, -80℃生涯或者干冰运输。

注重事项：

a. 送样优先顺序：?石蜡块＞石蜡卷＞石蜡切片

b. 所有石蜡组织样本需只管送检一年以内的样本，?不得凌驾18个月，建议提供一张免疫组化或组化染色切片

c. 新制切片常温安排应在1周以内，2-8℃安排应在1个月以内，-20℃贮存应在6个月以内

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d. 强烈建议每个贴片盒中只存放一个患者的样本；若需与其他患者样本放在一起，必需做距离区分，避免样本接触造成污染

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e. 强烈不建议使用添加瓦楞纸或自折Z形纸摆放石蜡切片，因运输历程中的碰撞会导致石蜡切片挤到一起，造成切片破损或样本污染。

石蜡组织容器

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石蜡切片示例

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2.6?非致病性细菌样本收罗

一次反应所需细菌的量≤1×107个

①显微镜下视察生长状态，网络对数生恒久细菌；

②将适量体积的菌液转移至2mL旋盖尖底RNase-Free离心管中，室温或4℃下14000g离心4-10min

③弃尽作育基，将细菌沉淀迅速置于?液氮速冻>1h，然后转移至-80℃或液氮中恒久生涯，干冰运输

2.7?非致病性真菌样本收罗

一次反应所需真菌的量≤50mg，将真菌称重，分装多管；将称重后的真菌置于预冷的耐-192℃超低温螺纹冻存管中，迅速投入液氮，速冻时间>1h，转入-80°C恒久生涯或用干冰直接寄出。

2.8 致病性真菌细菌处置惩罚要领

所有可能致病的真菌、细菌RNA项目样品，均需要按下面办法预处置惩罚以后才华寄送至公司，且需要提前通知实验室，明确菌种。溶液A，B可以向实验室索要。实验室将对未经处置惩罚的可能致病的样品，举行销毁处置惩罚

①细菌/真菌沉淀（不凌驾30mg，约绿豆大�。┘尤�400ul溶液A，奏乐重悬菌体。

②在重悬的菌体中加入400ul溶液B，强烈震荡混匀。

③65℃水浴或金属浴加热30min，每隔5min强烈震荡一次，避免分层。

④处置惩罚竣事以后，-80℃冻存，干冰运输。如为致病菌，请用70%乙醇处置惩罚容器外貌（注重如处置惩罚历程中编号模糊，处置惩罚后重新写好编号），确保清静。

注重事项：

（1）室温较低时溶液A可能析出沉淀，可65℃预热2-3min待沉淀消融后混匀使用。

（2）溶液B有侵蚀性，使用注重清静操作。溶液B为有机溶液，上层液体为水封，吸收时确保将枪头插入下层液体。

（3）溶液A，B不互溶，操作时需要震荡充分，使两种液体形成乳浊液。

（4）样品提交单上请注明：样品经由溶液A，溶液B预处置惩罚。

2.9?Total RNA样品

Total RNA一样平常恒久生涯于-80℃冰箱，若要寄送可直接使用干冰寄出，或加入适量生涯液，再用干冰运输。

RNA的生涯介质（建议浓度>50ng/μL）：

①RNA生涯液（1/10体积3M NaAc，pH=5.2，3倍体积无水乙醇）

②3倍体积无水乙醇

③RNase-free水（送样量>15μL）

注重事项：

(1) total RNA中应只管阻止多糖、卵白、DNA等杂质的残留，送样时需注明溶剂因素

(2) total RNA应阻止重复冻融，由于重复冻融所爆发的剪切力会对RNA样品有破损作用，以是在现实操作中，应对RNA样品小量分装

辅助质料

1. 样本包装注重事项

①在包裹样本的铝箔或冷冻生涯管外貌，用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且不要与乙醇等有机溶剂接触

②不要用纱布、纸张直接包裹样本，而是用铝箔或冷冻生涯管包裹后再装入样本袋中

③不要用玻璃容器在液氮中生涯样本；

④不要把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内，由于纸张在液氮中是易碎的

⑤标签纸应该贴于样本袋绳上，不要贴于容器外貌以免脱落造成样本杂乱

⑥ 不要在一只样本袋中放过多的样本，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷

⑦ 客户在填写《样本挂号单》时应当详细形貌（临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段）样本的类型、处置惩罚要领、贮存条件以及贮存时间等相关细节，以便手艺职员确定合理的实验计划

样本贮存注重事项

① 液氮速冻完毕后，携带样本的冻存管或锡箔纸等应该连忙放入-80℃生涯。通例样本在10min内必需连忙使用液氮速冻，不可直接将样本在未经液氮速冻处置惩罚后直接放入-80℃生涯。未经液氮淬灭的样本中还会残留低活性的酶，从而引起核酸降解以及卵白变性

② 组织样本收罗后，样本迅速放入入口高质量冻存管中，冻存管推荐使用入口的并且耐低温-192℃的螺纹口冻存管，拧紧后连忙放入液氮。然后再转移到-80℃中生涯。若是由于没有拧紧会导致液氮流入冻存管，空气热胀冷缩后爆发爆炸

③ 组织样本贮存于液氮或-80℃冰箱中。关于液氮生涯样本，务必注重，不要用非螺口离心管和国产冻存管，由于这些管子从液氮中取出时极易爆发管子爆裂而造成样本损失。建议使用第②条提到的冻存管。着实条件缺乏必需使用封口膜将离心管充分封闭避免爆炸（不推荐这样操作）

样本运输注重事项

① 飞机运输干冰上限约为20公斤，凌驾20公斤原则上不可运输�；鸪翟耸洳皇芟拗�。

② 干冰运输应接纳壁厚且质量完好的泡沫箱，质料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外衣纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提醒，以包管清静运输

③ 干冰运输可委托外地快递公司，只管确保48小时内送达公司，不可送货上门的应提前通知公司响应职员。

④ 24小时抵达的，干冰总量不得低于5公斤；48小时抵达的，干冰总量不得低于8公斤。夏日可以适当再多增添部分干冰（平时的1.5倍）。不要使用大块状干冰或完全呈粉末状的干冰，而是需要小的圆柱体干冰，不然运输历程中自重较量大的块状干冰可能会在箱内挤压样品盒，移动中可能造成样品盒破碎。若是只有大块状干冰可以使用，那么装箱时先砸碎成小块

⑤ 包装时建议用大塑料袋包裹干冰并在箱中放冰袋，可有用减缓干冰挥发速率。选择合适巨细，且箱壁较厚的泡沫箱，并在泡沫箱外纵横偏向都缠上透明胶，最好是将泡沫箱外壁用胶带笼罩一遍，带避免运输途中因挤压和投掷而破碎。泡沫箱所有缠上胶带后，为避免密封过紧，气密性过强，干冰挥发爆发过大压力而造成泡沫箱爆裂，用美工刀或其他薄刃刀具，将缠在泡沫盒盖和箱体接合处的胶带刺破一个1-2厘米的小误差，以在气压过高时倾轧气体

⑥ 如委托快递运输，运输历程中应随时跟踪货物的情形，纪录货单号，并坚持与发出地和吸收地的快递公司的联系

注重事项

① 客户若是提供冻存可苏醒的细胞株，应首先验证所用冻存要领用于RNA提取的可靠性，并且在送样时提供详尽的苏醒要领，以便确保实验乐成

② 所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本挂号表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处置惩罚情形等。

③ 提取RNA质与量：a. 处于差别发育阶段以及差别生长条件的样本中所含有的RNA、RNA以及卵白的量是差别的，在某些实验条件下或某些病变部位获得的样本中核酸的量可能与通例响应样本有显著的差别；b. 贮存条件以及贮存时间也是影响RNA质与量的要害因素。一样平常来说重新鲜的样本中总是能够获得预期的核酸量，并且含量相对较高，更容易检测。可是没有生涯在液氮或-80℃冰箱中的样本是不可靠的，因此，强烈建议尽可能低温生涯。

④ 关于备份，为确保实验的顺遂，我们强烈建议您在取样时，应同时备份2-3份，如备份3份，则送给我们两份，若是备份 2份，则送样一份，您自己留一份，以预防部分样本降解，重新取材或送样延伸您的时间。纵然样本所有及格，备份的样本您还可以用来举行其他方面的实验（如定量验证，卵白方面，生化方面的实验等）。备份又分为两种，一种为严酷备份，即样本取下后一分为二，这样的两份样本基本上具备同性子。另一种为非严酷备份，即生物学重复的样本，这样的备份样本同质性要较前者差。

样本寄送指南

① 将网络好的样本置于响应的网络管中，为避免样本混淆管盖和管壁均要誊写编号，并用封口膜封口；

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