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手艺专栏

什么是ELISA--原理与分类

供稿：手艺部

宣布时间：2022-05-23 金狮贵宾会-宾至如归-尊贵-显赫

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一、基来源理

1971年Engvall和Perlmann揭晓了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年最先用于抗原定位的酶标抗体手艺生长成液体标本中微量物质的测定要领。

这一要领的基来源理是：①使抗原或抗体团结到某种固相载体外貌，并坚持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶毗连成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保存其免疫活性，又保存酶的活性。在测准时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按差别的办法与固相载体外貌的抗原或抗体起反应。用洗涤的要领使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质脱离，最后团结在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产品，产品的量与标本中受检物质的量直接相关，故可凭证颜色反应的深浅举行定性或定量剖析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定要领抵达很高的敏感度。

二、要领类型和操作办法

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定要领中有3种须要的试剂：

①固相的抗原或抗体；

②酶标记的抗原或抗体；

③酶作用的底物；

凭证试剂的泉源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出州差别类型的检测要领。

（一）应用亲和素和生物素的ELISA

此要领是现在海内主流ELISA试剂盒厂商最常用的要领，有厂商称之为双抗夹心法，但与真正的“双抗夹心法”却有着很大区别。

亲和素是一种糖卵白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密团结。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，保存于蛋黄中。用化学要领制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与卵白质、糖类和酶等多种类型的巨细分子形成生物素化的产品。亲和素与生物素的团结，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经团结就极为稳固。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的团结位置，可以毗连更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就能大幅提高ELISA的信号强度。

亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大�？梢栽诠滔嗌舷仍ぐ磺缀退�，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素团结，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。这种包被法不但可增添吸附的抗体或抗原量，并且使其团结点充分袒露。另外，在通例ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替换，然后毗连亲和素-酶团结物，以放大反应信号。桥联法ABC-ELISA（avidin biotin complex-ELISA）夹心法测抗原的历程见图1。

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图1、亲和素-生物素系统ELISA

（二）竞争法

竞争法（图2-1）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体团结，因此团结于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作办法如下：

（1）将特异抗体与固相载体毗连，形成固相抗体。洗涤。

（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混淆溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺遂地与固相抗体团结。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的时机与固相抗体团结，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体团结的时机，使酶标抗原与固相载体的团结量镌汰。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的团结可达最充分的量。洗涤。

（3）加底物显色：参考管中由于团结的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，体现标本中抗原含量越多。

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图2-1、竞争法测抗原示意图

（三）双抗体夹心法

部分厂家习惯性把双抗夹心法做出来的产品称之为“一步法” “减步法” “one step” “quick” 等五花八门的名头，但其真正操作办法与双位点一步法在操作上有很大区别。

双抗体夹心法（图3）是检测抗原较量常用的要领，操作办法如下：

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图3、双抗体夹心法测抗原示意图

（1）将特异性抗体与固相载体毗连，形成固相抗体：洗涤除去未团结的抗体及杂质。

（2）加受检样本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让样本中的抗原与固相载体上的抗体团结，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未团结的物质。

（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体团结。彻底洗涤未团结的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产品。凭证颜色反应的水平举行该抗原的定性或定量。

凭证同样原理，将大分子抗原划分制备固相抗原和酶标抗原团结物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

（四）双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个差别抗原决议簇的单克隆抗体划分作为固相抗体和酶标抗体，则在测准时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图2）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

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图4、双位点一步法示意图

在一步法测定中，应注重钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带征象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原划分和固相抗体及酶标抗体团结，而不再形成夹心复合物，所得效果将低于现实含量。钩状效应严重时甚至可泛起假阴性效果。

（五）间接法测抗体

间接法（图5）是检测抗体最常用的要领，其原理为使用酶标记的抗抗体以检测已与固相团结的受检抗体，故称为间接法。操作办法如下：

（1）将特异性抗原与固相载体毗连，形成固相抗原：洗涤除去未团结的抗原及杂质。

（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原团结，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球卵白及血清中的杂质由于不可与固相抗原团结，在洗涤历程中被洗去。

（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体团结，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法只要替换差别的固相抗原，可以用统一种酶标抗体检测种种与抗原响应的目的待检抗体。

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图5、间接法测抗体示意图

（六）捕获法测IgM抗体

捕获包被法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型因素（如 IgM）的测定。以现在常用的 IgM 测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性 IgM 和 IgG 同时保存，而IgG可滋扰 IgM 的测定。因此先将一切血清 IgM（包括异性 IgM 和非特异性 IgM）牢靠在固相上，在去除 IgG 后再测定特异性 IgM。IgM 抗体的检测用于盛行症的前期确诊中。先用抗人 IgM 抗体包被固相，以捕获血清标本中的 IgM（其间包括针对抗原的特异性 IgM 抗体和非特异性的 IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性 IgM 相团结。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的 IgM 成正相关。此法常用于病毒性熏染的前期确诊。类风湿因子（RF）相同能搅扰捕获包被法测定 IgM 抗体，导致假阳性回声。因其中和 IgG 的间接法迩来颇受喜欢，用这类试剂检测抗 CMV IgGM 和抗弓形虫 IgM 抗体已获乐成。操作办法如下：

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图6、捕获法测IgM抗体示意图

（1）将抗人IgM抗体毗连在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球卵白和血清中的杂质因素。

（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM团结。洗涤。

（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与团结在固相上的抗原反应团结。洗涤。

（5）加底物显色：若有颜色显示，则体现血清标本中的特异性IgM抗体保存，是为阳性反应。

ELISA的手艺要点

ELISA的手艺要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。

一、试剂的制备

ELISA的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的质料和制备要领。

（一）固相载体

可作ELISA中载体的物质许多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附卵白质的性能，抗体或卵白质抗原吸附其上后保存原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成种种形式。在ELISA测定历程中，它作为载体和容器，不加入化学反应。加之它的价钱低廉，以是被普遍接纳。ELISA载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一样平常为直径0.6cm的圆球，外貌经磨砂处置惩罚后吸附面积大增添。如用特殊的洗涤器，在洗涤历程中使圆珠转动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于ELISA测定的产品也称为ELISA板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或12联孔条的，放入座架后，巨细与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时举行大宗标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出效果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等办法，对操作的标准化极为有利。优异的ELISA板应该是吸附性能好，空缺值低，孔底透明度高，各板之间和统一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的差别和制作工艺的差别，州产品的质量差别很大。因此每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查要领为：以一定浓度的人IgG（一样平常为10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后划分测每孔溶液的吸光度�？刂品从μ跫�，使各读数在0.8左右。盘算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10％。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对卵白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空缺值有时也略高。为较量差别固相在某一ELISA测定中的优劣，可用以下要领加以磨练：用其它免疫学测定要领选出一个典范的阳性标本和一个典范的阴性标本。将它们划分举行一系列稀释后，在差别的固相载体上按预定的ELISA操作办法举行测定，然后较量测定效果。在哪一种载体上阳性效果与阴性效果判别最大，这种载体就是这一ELISA测定的最合适的固相载体。除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体尚有两种质料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，这类测定形式将在“膜载体的酶免疫测定”中先容。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应竣事后用磁铁吸引作为疏散的手段，洗涤也十分利便，但需配备特殊的仪器。

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